Молекулярно-біологічні методи дослідження та їх використання
Молекулярно-біологічні методи дослідження відіграють велику роль в сучасній медицині, криміналістиці і біології. Завдяки досягненням в області вивчення ДНК і РНК, людина здатна вивчити геном організму, визначити збудника захворювання, розпізнати потрібну нуклеїнових кислот в суміші кислот і т.д.
Содержание
Молекулярно-біологічні методи дослідження. Що це таке?
Ще в 70-80-х роках ученим вперше вдалося розшифрувати геном людини. Ця подія дала поштовх розвитку генної інженерії і молекулярної біології. Вивчення властивостей ДНК і РНК призвело до того, що тепер можна використовувати ці нуклеїнові кислоти з метою діагностики захворювання, вивчення генів.
Отримання ДНК і РНК
Молекулярно-біологічні методи діагностики вимагають наявності вихідного матеріалу: частіше це нуклеїнові кислоти. Існує кілька способів виділення цих речовин з клітин живих організмів. Кожен з них має свої переваги і недоліки, і це треба враховувати при виборі методу виділення нуклеїнових кислот в чистому вигляді.
1. Отримання ДНК по мармуру. Метод полягає в обробці суміші речовин спиртом, в результаті чого чистий ДНК випадає в осад. Мінусом цього способу є використання агресивних речовин: фенолу і хлороформу.
2. Виділення ДНК з Буму. Основна речовина, що використовується тут, - це гуанидин тіоціонат (GuSCN). Воно сприяє осадженню дезоксирибонуклеїнової кислоти на спеціалізованих субстратах, з яких в подальшому можна її зібрати за допомогою спеціального буфера. Однак GuSCN - це інгібітор ВТЦ, і навіть невелика його частина, що потрапила в обложену ДНК, може вплинути на хід полімеразної ланцюгової реакції, яка відіграє важливу роль при роботі з нуклеїновими кислотами.
3. Осадження домішок. Метод відрізняється від попередніх тим, що осідають не власними молекули дехоксірібонуклеіновой кислоти, а домішки. Щоб це здійснити, використовують ионообменники. Недолік у тому, що не всі речовини можуть облоги.
4. Масовий скринінг. Використовується цей спосіб в тих випадках, коли не потрібні точні відомості про склад молекули ДНК, а необхідно отримати якісь статистичні дані. Пояснюється це тим, що структура нуклеїнової кислоти може пошкодитися при обробці детергентами, зокрема, лугами.
Класифікація методів дослідження
Всі молекулярно-біологічні методи дослідження діляться на три великі групи:
1. ампліфікаціонних (з використанням безлічі ферментів). Так само як ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція, яка відіграє велику роль у багатьох з методів діагностики.
2. неампліфікаціонние. Ця група методів пов`язана безпосередньо з роботою сумішей нуклеїнових кислот. Прикладами є 3 види блоттинга, in situ гібридизація і т.д.
3. Методи, засновані на розпізнаванні сигналу від молекули зонда, який зв`язується з певною ДНК або РНК зонда. Приклад - система гібридизації в розчині Hybride Capture System (hc2).
Ферменти, які можуть використовуватися в молекулярно-біологічних методів дослідження
Багато методи молекулярної діагностики мають на увазі використання великого діапазону ферментів. Нижче представлені застосовуються найчастіше:
1. рестріктаза - «ріже» молекулу ДНК на необхідні частини.
2. ДНК-полімераза - синтезує двухцепочечную молекулу дезоксирибонуклеїнової кислоти.
3. Зворотна транскриптаза (ревертаза) - використовується для синтезу ДНК на матриці РНК.
4. ДНК-лігаза - відповідає за освіту фосфодіефірних зв`язків між нуклеотидами.
5. екзонуклеаза - видаляє нуклеотиди з кінцевих ділянок молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти.
ПЛР - основний спосіб ампліфікації ДНК
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) активно використовується в сучасній молекулярній біології. Це метод, при якому з однієї молекули ДНК можна отримати величезну кількість копій (ампліфікувати молекули).
Основні функції ПЛР:
- діагностика захворювань;
- клонування ділянок ДНК, генів.
Для проведення полімеразної ланцюгової реакції необхідні наступні елементи: вихідна молекула ДНК, термостабильная ДНК-полімераза (Taq або Pfu), дезоксірібонуклеотідов-фосфати (джерела азотистих основ), праймери (2 праймера на 1 молекулу ДНК) і сама буферна система, в якій можливе проведення всіх реакцій.
ПЛР складається з трьох етапів: денатурація, отжиг праймерів і елонгація.
1. Денатурація. При температурі 94-95 градусів за Цельсієм просходит розрив водневих зв`язків між двома ланцюгами ДНК, і в результаті ми отримуємо дві одноцепочечниє молекули.
2. Відпал праймерів. При температурі 50-60 градусів за Цельсієм відбувається приєднання праймерів на кінцях одноланцюгових молекул нуклеїнової кислоти за типом компліментарності.
3. Елонгація. При температурі 72 градусів відбувається синтез дочірніх дволанцюжкових молекул дезоксирибонуклеїнової кислоти.
секвенування ДНК
Молекулярно-біологічні методи дослідження часто вимагають знання послідовності нуклеотидів в молекулі дезоксирибонуклеїнової кислоти. Для визначення генетичного коду проводиться секвенування. Молекулярна діагностика майбутнього буде заснована на знаннях, отриманих при визначенні послідовності людини.
Виділяють наступні види секвенування:
- секвенування по Максама-Гилберту;
- секвенування по Сенгер;
- піросеквенірованія;
- нанопоровое секвенування.
